Saccharomyces cerevisiae: su domesticación y el parentesco de sus cepas…

Hace un par de años atrás, en el 2016, se publicó un trabajo (Gallone et al. 2016) que por primera vez trató el tema de la domesticación de la levadura cervecera utilizando herramientas de genética. Además permitió establecer las relaciones de parentesco entre distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae que se utilizan para fermentar distintas bebidas (cerveza, vino, sake), alimentos (pan), y bio-etanol, entre otros productos.

Si bien está establecido que las cervezas fermentadas nos acompañan desde la prehistoria (Michel, McGovern, and Badler 1992), es sólo recientemente que, gracias al trabajo de Lois Pasteur y Emil Hansen durante el siglo 19, utilizamos mono-cultivos para la fermentación de cerveza. Se cree que aún previo a la industrialización de la producción de cerveza, desarrollada partir de fines del siglo 17, se entendía que reutilizar la levadura, aunque no se supiese qué era la levadura, resultaba en mejores fermentaciones. Es por ello, que se postula la hipótesis de domesticación.

La reutilización provee un entorno ideal para la domesticación al proveer un medio de cultivo “artificial” (entendiéndose por ello, fabricado por el hombre y distinto al que existe en la naturaleza) al cuál adaptarse. También provee el otro elemento crucial para la evolución: la selección, en este caso impuesta por el hombre al favorecer las microorganismos de fermentaciones “exitosas”; por ende ejerciendo una presión selectiva. Además, la reutilización continua “mantiene” los cambios poblacionales y además aísla la levadura de su ambiente natural.

Vale la pena aclarar qué se entiende en el ámbito académico por domesticación: la selección o cruzamiento de especies salvajes, por humanos, para obtener cepas cultivadas que se adapten mejor a ambientes “artificiales”, es decir, hechos por el hombre (como podría ser un mosto), pero se comportan de manera subóptima en la naturaleza.

Sin embargo, no había evidencia sólida para poder sopesar entre una hipótesis de domesticación humana de las cepas de levaduras usadas industrialmente o comercialmente y su evolución por otros factores de presión y selección externos, como por ejemplo la aislación geográfica (Warringer et al. 2011).

Relaciones de parentesco entre cepas…

En (Gallone et al. 2016) analizaron 157 cepas de S. cerevisiae, utilizadas en procesos industriales, como ser elaboración de cerveza, sake, vino, bioetanol, y destilados así como cepas utilizadas en ámbito de investigación. Los datos obtenidos apoyan la hipótesis de domesticación, ya que encontraron que las cepas industriales provienen de un conjunto limitado de cepas ancestrales y son genotípicas y fenotípicas distintas que las cepas salvajes.

Ahora, un pequeño paréntesis, por genotípicamente diferente se entiende que su genética es distinta, por ejemplo: teniendo un número distinto de cromosomas o genes diferentes. Y por fenotipo se entiende la expresión del genotipo en un ambiente particular, es decir las características que exhibe la cepa.

Retomando, no sólo demuestran su domesticación, sino que catalogan a las cepas estudiadas en cinco clados (ramificaciones del árbol filogenético, que muestra las relaciones evolutivas), a saber:

  • uno que contiene a las levaduras Asiáticas incluyendo a las de sake
  • uno que contiene principalmente levaduras utilizadas en la elaboración de vino
  • uno mixto que contiene las levaduras utilizadas en panificación y unas pocas otras
  • dos para levaduras cerveceras que corresponden a dos familias diferentes

Cabe resaltar que la mayoría de los clados no les corresponde sub-estructuras geográficas, con excepción de uno de los de cerveza. En dicho clado (llamado BEER I) se encuentran sub-grupos aislados de cepas originarias de Europa Continental (Alemania y Bélgica), el Reino Unido, y descendientes recientes de cepas de Estados Unidos que divergieron de las inglesas a partir de la época colonial. La ausencia de mezcla genética entre las cepas de dichas sub-poblaciones indica que las cepas divergieron estando aisladas geográficamente. 

Si bien no hay sub-estructuras geográficas en la mayoría de los clados, si existen patrones geográfico dentro y entre los mismos. Por ejemplo, la mayoría de las cepas de sake, las cepas salvajes de China y las cepas utilizadas en China para la producción de bioetanol, están relacionadas. De forma similar, las cepas utilizadas para la producción de bioetanol en Sudamérica están relacionadas con las cepas utilizadas en la producción de cachaza en Brasil. 

El clado mixto (MIXED) contiene al 7.8% de las cepas cerveceras, la mayoría de las cuales son cepas “atípicas” utilizadas principalmente para refermentación en botellas de cervezas belgas de alto contenido alcohólico, y a todas las cepas utilizadas en panificación. 

Las cepas de vino y sake se agrupan en los clados: WINE y ASIA previamente descritos en (Liti et al. 2009). 

La mayoría de las levaduras cerveceras (85.3%) se encuentran en BEER I o BEER II, que están relacionados distantemente. La alta diversidad observable en el grupo BEER I, que excede la que existe dentro de la población de levaduras de vino, sugiere que dicha separación no es reciente. En relación al clado BEER I, el clado BEER II es más cercano al linaje de cepas de vino e incluye el 20.6% de todas las cepas cerveceras analizadas. Sin embargo, el clado BEER II carece de estructura geográfica (como sí presenta el BEER I) aún habiendo cepas dentro del clado originarias de Bélgica, Alemana, Estados Unidos y el Reino Unido. La existencia de dos fuentes distintas de cepas cerveceras apoya la idea de que existieron dos eventos de domesticación independientes en Europa: uno que originó el clado BEER I y el otro que se encuentra al origen de tanto BEER II como el de cepas de vino (WINE). 

Las cepas utilizadas en la industrias de destilación no presentan un relación filogenética evidente, se encuentran dispersas entre las distintas poblaciones y son en general cepas mosaícas (que son aquellas donde coexisten dos o más poblaciones de células con distinto genotipo); las autores proponen que puede deberse a que se trata de cepas que son el producto de cruzas modernas realizadas por empresas que venden cepas a productores de destilados. Además, en la fabricación de destilados no se reutiliza la levadura, limitando las oportunidades evolutivas para que se desarrollen divergentemente generando propio clado.

Gráficamente:

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Árbol filogenético de levaduras S. cerevisiae estudiadas

¿Qué les permite inferir que fueron domesticadas?

El trabajo presenta evidencia de domesticación desde diferentes perspectivas. Primero, muestran que existe una alta variación en la estructura genética de las levaduras,  normalmente encontrada en situaciones de domesticación y/o adaptación a nichos artificiales específicos (como el caso de micro-organismos que se los hace evolucionar de forma controlada en un laboratorio ).

Segundo, evaluaron la capacidad reproductiva de las distintas cepas y su capacidad de soportar factores de estrés típicos de los ambientes naturales pero que no son los factores de estrés de fermentaciones industriales. Los resultados les permiten inferir que las levaduras cerveceras, pero no así  las de vino, muestran pérdidas o desmejora en características de supervivencia necesarias en ambientes naturales pero que no presentan ventajas competitivas en fermentaciones industriales.  

Tercero, analizaron la adaptación fenotípica a ambientes artificiales y la profundización de características favorecidas por los humanos. Para ello, evaluaron el desempeño en cuanto a características relevantes para la industria y específicamente para la aplicación particular de cada cepa. Por ejemplo, tolerancia al alcohol, la fermentación de maltotriosa, y la producción de fenoles (4-vinyl guaiacol específicamente).

Algunos resultados interesantes sobre S. Cerevisiae 

De los experimentos realizados para comprender si efectivamente las cepas estudiadas mostraban rasgos de domesticación, surgieron algunos datos interesantes sobre las distintas poblaciones de levadura S. cerevisiae.

Manejo de estrés

Las cepas dentro del clado de vino muestran mejor desempeño en condiciones generales de estrés y de supervivencia en ambientes de escasos nutrientes. Los autores suponen que lo primero podría estar relacionado con el ambiente de estrés que presenta una fermentación de mosto de uva (alto contenido de azúcares y luego alta concentración alcohólica), y lo segundo, al ambiente natural al que se enfrentan entre cosechas.

Las cepas de BEER I típicamente generan solo 7.5%-10% v/v de etanol, mientras que las cepas de sake, vino, destilados o bioetanol pueden llegar hasta 14.5% v/v.

Maltosa y Maltotriosa

Varios de los genes involucrados en el transporte y degradación de maltosa (azúcar más preponderante en un mosto cervecero, presente en un mosto de sake, y ausente de un mosto de uva) se encuentran amplificados en las sub-poblaciones de levaduras cerveceras y de sake, y se han perdido en varias cepas de vino.

Las levaduras cerveceras muestran mejor capacidad para metabolizar la maltotriosa  (azúcar específico de los mostos de cerveza). Además, encontraron que el mecanismo de transporte de maltotriosa que está estudiado es el que utilizan las levaduras del clado BEER  I, pero que los genes responsables no se encuentran en la población BEER II ni en la de vinos. Esto es notable ya que cepas de BEER II tienen la capacidad de utilizar maltotriosa y por ende existe otro mecanismo aún no conocido que se los permite. Además, esto implica que dicho mecanismo evolucionó de forma convergente en ambos linajes cerveceros. 

Reproducción

El comportamiento reproductivo de los distintos clados es bastante diferente: 44.4% de BEER I son obligatoriamente asexuales (no esporulan), mientras que en los otras poblaciones es del 0 al 21% solamente y está ausente en las cepas salvajes (es decir, todas esporulan). Es más, de las cepas capaces de esporular de BEER I, que no son mosaicos genéticos, más del 80% muestran ninguna o escasa viabilidad de las esporas.

Fenoles

Más allá de ser tolerado e incluso ser emblemático de algunos estilos, los fenoles, y específicamente el compuesto  4-vinil-guayacol (4-VG en adelante) que posee un aroma especiado a clavo de olor, es generalmente considerado un defecto en sake, vinos y la mayoría de los estilos cerveceros. Incluso, en el caso de cerveza, puede ser indicativo de una contaminación con levadura salvaje.

Los genes que controlan la producción de 4-VG expresan encimas que además son ayudan en la detoxificación de los ácidos acrílicos presentes en la pared celular de plantas. Por lo tanto, es esperable que se retengan la actividad de dichos genes, a menos que exista una presión que desfavorezca su retención.

Durante el perfilado fenotípico realizado se comprobó que la mayoría de las cepas industriales analizadas habían perdido su capacidad de producir 4-VG, mientras que las cepas salvajes y las utilizadas en panificación o bioetanol lo habían conservado. Cuestión que es esperable ya que durante la cocción del pan el aroma se pierde y en bioetanol su presencia no altera la calidad del producto (dado que no es un producto para consumo humano).

Sin embargo, los diferentes sub-linajes de S. cerevisiae presentan distintas mutaciones que inhiben su la producción de 4-VG. Esto le da peso a la hipótesis de múltiples estrategias adaptativas surgidas de la presión selectiva ejercida por el humano al favorecer cepas que no producían aromas a fenoles. Es más, dichas mutaciones se produjeron muy temprano en el linaje del clado BEER I. 

Cabe preguntarnos qué pasa en el caso de las levaduras utilizadas para la producción de Hefeweizen (estilo marcado por la presencia de fenoles). El estudio incluyó tres cepas utilizadas en la elaboración de Hefeweizen y encontraron que si bien dichas cepas se encuadran dentro del clado BEER I, se trata de cepas que son mosaico genéticos. Poseen partes del genoma de los tres sub-clados de BEER I (aunque principalmente de Bélgica/Alemania), y un pequeña porción de su genoma (8-13%) que origina en cepas de vino; pero es de aquí que adquieren los genes para producir fenoles. Esto sugiere que eventos de hibridación entre sub-poblaciones condujo a cepas que expresaban características típicas de levaduras cerveceras, como ser la fermentación de maltotriosa, pero además traían una característica de las cepas de vino (producción de 4-VG). 

Y… ¿cuándo pasó?

Comúnmente mediante métodos de genética es muy difícil poder datar cuándo se origina una cepa o una mutación específica. Sin embargo, el caso del clado BEER I presenta una oportunidad para hacerlo; ello se debe que como es un conjunto de cepas que no se reproducen sexualmente ni se han mezclado, permite asumir que hubo únicamente reproducción clonal en su evolución. Además, el análisis mostró que las cepas de Estados Unidos son las más cercanas a las Europeas, sugiriendo que fueron importadas desde Europa durante la colonización americana (en lugar de haberse originado a partir de especies salvajes autóctonas de América). De hecho, la relación es más próxima con las levaduras Británicas (dentro de las Europeas) lo que indica fuertemente que las cepas cerveceras de Estados Unidos fueron introducidas por colonos británicos durante el siglo 17, al iniciarse la producción de cerveza en la colonia.

El esquema de trabajo de una planta cervecera, desde que se inventó la refrigeración (e incluso antes en algunos climas), no es estacional sino que se desarrolla a lo largo de todo el año. Además, como ya se mencionó, en el caso de la cerveza se reutiliza la levadura. Estos dos factores le proveyeron a las levaduras cerveceras un ambiente estable y perdurable en el tiempo. En contraste con lo que ocurre en una bodega, dónde se produce en un único momento del año y luego la levadura deben sobrevivir en su ambiente natural. Dicha situación particular de uso de las cepas cerveceras les permite a los autores estimar la cantidad de generaciones de levaduras que ocurren anualmente.

La tasa de reproducción de levaduras en mosto y el tiempo transcurrido desde que se separó el linaje de levaduras de Estados Unidos del clado BEER I, les permite a los autores obtener un valor para la frecuencia de mutaciones que ocurren en una población de levaduras utilizadas en producción cervecera.

En base a dicho valor, pueden estimar de cuando data el último ancestro común de los sub-clados de BEER I: AD 1573–1604, que indicaría cuando sería el inicio de la domesticación. Es notable que coincide con los datos históricos de cuándo se transicionó de una producción cervecera hogareña a producciones de mayor escala, ya sea en monasterios o fábricas comerciales. El mismo valor de frecuencia de mutaciones les permitió datar al ancestro común del clado BEER II en: AD 1645–1671. 

Es interesante notar que ambos eventos de domesticación ocurren antes del descubrimiento de micro-organismos y mucho antes de la aislación de una cepa (realizado por Emil Hansen de Carlsberg en 1883); previamente la levaduras utilizadas no eran mono-cultivos de una cepa sino un conjunto de cepas que co-existían. Sin embargo, la domesticación es mucho posterior al momento en que el hombre comenzó a elaborar cerveza.

A pesar de la dificultad inherente a intentar identificar cuántas cepas diferentes fueron originalmente domesticadas y en qué contexto industrial, los resultados genéticos que agrupan a todas las cepas estudiadas en un número pequeño de clados y la clara segregación con las cepas salvajes, parece indicar que las cepas utilizadas actualmente surgen de un pequeño grupo de cepas ancestrales o de varios grupos de cepas ancestrales íntimamente relacionados.

Conclusión

Los resultados descritos muestran que las cepas de S. cerevisiae utilizadas industrialmente están genéticamente y fenotípicamente separadas de las cepas salvajes gracias a la presión selectiva impuesta por el hombre y al intercambio de cepas entre humanos. Es decir, fueron domesticadas. Las cepas industriales parecen haberse originado a partir de un pequeño número de cepas ancestrales que posteriormente evolucionaron en linajes adaptados/seleccionados específicamente para una aplicación industrial. Dicha domesticación se inició hace por lo menos unos cientos de años; incluso antes de que descubriera la existencia de micro-organismos.

Es interesante observar que la domesticación parece haber sido mucho más marcada en las levaduras cerveceras, y dentro de las mismas las del clado BEER I exhiben más fuertemente las consecuencias de la domesticación. Muchas de las características fenotípicas del proceso de domesticación pueden deberse simplemente a una mejor adaptación a los procesos de producción industrial. Sin embargo, otras características parecen haber sido seleccionadas por humanos (como por ejemplo la selección de cepas que no producen ciertos off-flavors). 

Resumido gráficamente:

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Domesticación de levaduras S. cerevisiae industriales

El análisis del árbol evolutivo de las cepas estudiadas muestra que la divergencia de las cepas depende de su aplicación industrial y su origen geográfico. La mayoría de las levaduras se agrupan según su uso industrial y están claramente separadas de las cepas salvajes y/o de laboratorio.

Vale la pena recalcar que no se detectó evidencia, salvo en el caso puntual de las levaduras Hefeweizen, de agrupamiento de levaduras según estilos de cerveza. Probablemente se deba a que la mayoría de cervecerías sólo tenían un “house strain” que utilizaban para todas sus cervezas.  

Antes de cerrar, vale la pena una aclaración: el estudio se enfocó en S. cerevisiae, o sea la levadura de fermentaciones ale. Si bien en el mismo se incluyeron 10 cepas comúnmente utilizadas para la producción de lagers, eran cepas de S. cerevisiae, y no S. pastorianus, que es la especie utilizada en fermentaciones lagers y es pariente de la levadura S. cerevisiae. Un poco de historia sobre S. pasteorianus y su parentezco quedará pendiente para otro artículo.

Referencias

Gallone, Brigida, Jan Steensels, Troels Prahl, Leah Soriaga, Veerle Saels, Beatriz Herrera-Malaver, Adriaan Merlevede, et al. 2016. “Domestication and Divergence of  Saccharomyces Cerevisiae  Beer Yeasts.” Cell166 (6): 1397–1410.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.08.020.

Liti, Gianni, David M Carter, Alan M Moses, Jonas Warringer, Leopold Parts, Stephen A James, Robert P Davey, et al. 2009. “Population Genomics of Domestic and Wild Yeasts.” Nature 458 (February): 337-. https://doi.org/10.1038/nature07743.

Michel, Rudolph H., Patrick E. McGovern, and Virginia R. Badler. 1992. “Chemical Evidence for Ancient Beer.” Nature 360 (6399): 24–24. https://doi.org/10.1038/360024b0.

Warringer, Jonas, Enikö Zörgö, Francisco A. Cubillos, Amin Zia, Arne Gjuvsland, Jared T. Simpson, Annabelle Forsmark, et al. 2011. “Trait Variation in Yeast Is Defined by Population History.” Edited by Leonid Kruglyak. PLoS Genetics 7 (6): e1002111. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002111.

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