Biotransformación de Glucósidos: ¿Realidad o mito? ¿Qué dice la academia?

Uno de los temas más controversiales entre los cerveceros artesanales, ya sean profesionales o caseros, es el de la biotransformación. En este artículo vamos a responder qué es lo que la academia entiende por biotransformación, que puede o no corresponderse con lo entienden los cerveceros, y después discutir los resultados de distintos trabajos académicos que buscan cuantificar los efectos de un tipo específico de biotransformación: la hidrólisis de glucósidos.

Hagamos rápidamente un repaso de lo que es la biotransformación, ya cubierta en un artículo anterior que recomendamos leer primero. 

¿Qué es la biotransformación?

Primero tenemos que partir de un punto común y para ello hay que definir qué entendemos por biotransformación: la alteración química de un compuesto por parte de un organismo.

En el caso específico de la elaboración de cerveza, una definición general podría ser: la modificación de un compuesto por parte de un microorganismo cervecero. En el caso de la mayoría de las cervezas la modificación sería realizada por una levadura ale o lager, pero si hablamos de una cerveza ácida, o de fermentación espontánea, también podría deberse a alguna bacteria y/o otro microorganismo, como por ejemplo Brettanomyces.

En el ambiente cervecero es muy común que se restrinja la definición aún más, imponiendo la condición de que la transformación se realice sobre un compuesto que provenga del lúpulo (en general dentro de los aceites esenciales) y que resulte en un compuesto aromático (ya sea que provenga o no de uno). En este artículo vamos a tomar este enfoque y discutir literatura que trate específicamente de transformaciones efectuadas por la levadura sobre compuestos del lúpulo.

A grandes rasgos, podemos hablar de dos mecanismos de biotransformación de compuestos del lúpulo por parte de la levadura:

  • la modificación de un compuesto en otro (por ejemplo, la conversión de geraniol en citronelol)
  • la hidrólisis de un glucósido

En este artículo vamos a tratar únicamente el segundo caso. El artículo científico de revisión (Praet, Van Opstaele, Jaskula-Goiris, Aerts, & De Cooman, 2012) provee un excelente resumen de ejemplos del primer tipo y que además hemos analizado en un artículo previo.

¿Qué es un glucósido?

En química, un glucósido es una molécula, no volátil ni aromática, dónde un azúcar, llamada glicona, está unida a otro grupo funcional, llamado aglicona, a través de un enlace glicosídico. Este enlace puede romperse mediante una hidrólisis enzimática, liberando la aglicona.  

En el contexto de biotransformación de compuestos del lúpulo mediante levaduras/microorganismos, lo que nos interesa es cuando la aglicona se trata de un compuesto aromático, que puede ser liberado por acción de una enzima. Es más, en este caso el azúcar, la glicona, se trata de una glucosa y la enzima de β-glucosidasa. Gráficamente:

glycosidasa

¿Por qué nos interesa?

Desde hace tiempo se discute, sobre todo en revistas del ámbito de cervecero casero, la posibilidad de que la levadura libere, mediante el enzima la β-glucosidasa, compuestos aromáticos volátiles, específicamente monoterpenos, a partir de glucósidos del lúpulo. De esta forma realzando la expresión  aromática de la cerveza.

Si bien no he podido rastrear exactamente de dónde surge esta idea, parecería ser de un artículo del blog «beer sensory science» titulado «Glycosides: The Hidden Flavors«, que parece haber sido el disparador otro artículo. En este caso, de la revista de cerveceros caseros Brew Your Own titulado «The Science of Hop Glycosides: Hop aroma buried under your nose«, escrito por el famoso Michael Tonsmeire. Además, con el advenimiento de las New England IPA y la técnica de realizar el dry hop durante la fermentación, es decir en presencia de levadura, la biotransformación ha tomado un nivel casi mítico. 

[Un paréntesis: es importante no confundir este tipo de biotransformación con la modificación de un compuesto en otro (por ejemplo, la conversión de geraniol en citronelol), realizada por la levadura mediante otros mecanismos (distintos a la hidrólisis de glucósidos). Éstas transformaciones se encuentran más estudiadas académicamente (ver el trabajo de (Praet, Van Opstaele, Jaskula-Goiris, Aerts, & De Cooman, 2012)) y se sabe que son responsables de ciertos cambios aromáticos que explican, al menos en parte, la diferencia en perfil aromático entre un dry hop hecho durante la fermentación y uno realizado en ausencia de levadura].

¿Qué nos dice la academia?

El primer trabajo que trata el tema de glucósidos en cerveza y/o lúpulos data del año 1999 (Goldstein, Ting, Navarro, & Ryder, 1999)  y fue realizado por Miller Brewing Company e incluso resultó en una patente (Murakami, Navarro, Ryder, & Goldstein, 2006). En dicho trabajo los autores documentan que encontraron glucósidos en el residuo vegetal que queda luego de la extracción, mediante CO2 supercrítico, al producir extractos de lúpulo. De hecho, su interés surgió porque notaron que los resultados de hacer una adición de lúpulo durante el hervor resultaba en un perfil aromático diferente si se usaba el extracto de dicho lúpulo y por ello deciden buscar «responsables aromáticos» en la fracción del lúpulo soluble en agua, documentando en el proceso la existencia de glucósidos aromáticos en el lúpulo por primera vez.  Además,  determinaron que se los podía liberar mediante enzimas, y comentan que esta posibilidad podría abrir las puertas a obtener componentes aromáticos a partir de un producto residual.

En (Kollmannsberger, Biendl, & Nitz, 2006) documentan la existencia de glucósidos en el lúpulo y que cada variedad de lúpulo tiene distintos glucósidos en diferentes cantidades. Además, observan que se encuentran en diferentes concentraciones en diferentes tipos de extractos de lúpulo (con respecto al total existente en los pellets pre-extracción); por ejemplo, cero (o casi cero) en extractos realizados con CO2 supercrítico (al igual que el estudio anterior, los encontraron en la fracción que se descarta post-extracción). También verificaron, mediante el uso de enzimas, la liberación glucósidos de una cerveza preparada con extractos. 

Otra pieza importante en este rompecabeza es el trabajo de (Daenen et al., 2007) dónde analizan la actividad que exhiben 36 cepas de levadura cervecera incluyendo ejemplares de Saccharomyces cerevisiae,  levadura «Ale», y Saccharomyces pastorianus, levadura «Lager». Además, incluyeron en el estudio una cepa de levadura de vino y 13 cepas de levadura Brettanomyces. Encontraron que sólo unas pocas especies de Saccharomyces expresaban una actividad real de 1,4-β-glucosidasa, necesaria para liberar los compuestos aromáticos. Una hidrólisis de glucósidos limitada, que podría llegar a liberar algunos compuestos aromáticos, fue observada y atribuida a la enzima exo-1,3-β-glucanasa, cuyo nivel de actividad era dependiente de cada cepa de levadura.  De hecho, los ensayos realizados para evaluar si las cepas Saccharomyces servían para liberar componentes aromáticos de los glucósidos del lúpulo no tuvieron resultados alentadores.

Por otro lado, observaron una actividad más pronunciada de la β-glucosidasa en células de levadura no Saccharomyces, particularmente en una cepa de Brettanomyces custersii, aislada de la fermentación de una cerveza Lambic. De hecho en otro trabajo (Daenen, Sterckx, Delvaux, Verachtert, & Derdelinckx, 2008) utilizaron dicha cepa de Brettanomyces para lograr liberar glucósidos de cerezas, con resultados positivos e interesantes para la elaboración de cervezas Kriek.

En (Takoi et al., 2010), los autores confirman que hay actividad enzimática para hidrolizar glucósidos en cerveza, y además muestran que agregando una enzima comercial de 1,4-β-glucosidasa logran liberar más compuestos aromáticos. 

Finalmente, llegamos al trabajo más reciente del tema (Sharp, Steensels, & Shellhammer, 2017). A diferencia de los trabajos anteriores, presenta un panorama bastante menos alentador a la posibilidad de liberar compuestos aromáticos mediante levaduras.  Al igual que en el trabajo de Daenen et. al confirman la actividad de β-glucosidasa de múltiples cepas de levadura y observan la misma tendencia: mayor expresión en Brett y cepas de vino que de Ales/Lagers (aunque hay cepas cerveceras con mayor expresión que muchas de las vínicas analizadas).  Además, analizan cuándo y hasta qué punto ocurre la hidrólisis de glicósidos en una fermentación. Para ello registran la liberación, durante la fermentación, de una aglicona a partir de un glicósido «artificial» agregado (es decir, no presente naturalmente en mosto ni en lúpulo). Los resultados que obtienen, resumidos en la siguiente gráfica, no son muy prometedores: independiente de la capacidad de hidrólisis enzimática de glicósidos de la levadura (ensayan con una con alta y otra baja capacidad) el porcentaje de conversión es bajo (10%). La única diferencia dada por la diferencia en capacidad es cuán rápido ocurre (48 versus 72 hs aprox.). 

hidrolisis-octyl
Hidrólisis del octil-glucopiranosido

El próximo ensayo que realizan es ver si la liberación de agliconas aromáticas puede ser mejorada a través del uso de enzimas exógenas. El experimento que realizan consiste en evaluar la concentración de múltiples monoterpenos aromáticos presentes en el lúpulo como glicósidos, incluyendo linalool, geraniol, nerol, β-citronelol, α-terpineol, luego de la adición de la enzima exógena β-glucosidasa (durante 72 horas). El objetivo es verificar la hipótesis que dicta que monoterpenos aromáticos son liberados, por hidrólisis enzimática, durante la fermentación. El ensayo lo repiten con múltiples variedades de lúpulo  y con diferentes tipos de adiciones: sólo de hervor (60 min), de whirlpool (con un descanso de 25 min) y dry hop (estático de 72 hs a 18 °C). Vale la pena aclarar que para poder cuantificar el efecto de la hidrólisis enzimática independientemente al de otras reacciones que ocurren durante la fermentación, los ensayos se realizaron sobre mosto y no cerveza fermentada o mosto en fermentación (así anulando el efecto de otras posibles transformaciones realizadas por la levadura). Si bien el ambiente donde actuaría la enzima en cada caso (mosto vs. cerveza) es distinto (pH, contenido alcohólico, etc.) los autores justifican que ello no debería tener un impacto sobre la liberación de compuestos aromáticos adicionales y les permite, como se comentó anteriormente, aislar el fenómeno de otros que ocurren durante la fermentación. Los autores no encontraron un diferencia significativa (estadísticamente) entre ambos tratamientos (con y sin enzima) para ninguno de los componentes aromáticos analizados. El siguiente gráfico muestra el resultado obtenido para linalool, a modo de ejemplo.

linalool-exo-beta-glucosidasa
Concentración de linalool con enzima (azúl) y sin enzima (naranja) para múltiples variedades de lúpulo (CEN: Centennial, CTZ: Colombus, HHA: Haller Mittlefrueh, SIM: Simcoe) bajo distintos tratamientos de lupulado (DH: Dry Hop 72 hs a 18 °C), KH: Hervor 60 min, WH: Whirlpool 25 min, UH: Control, mosto sin lupular).

Dado los resultados negativos de este último trabajo, cabe preguntarnos por qué otros autores si observaron diferencias. La primera cuestión que se puede notar es que los otros trabajos no realizaron un análisis estadístico, y en su mayoría sólo hicieron una única repetición de los ensayos. Otra cuestión es que el aporte adicional, en los estudios que se detectó, es pequeño en relación a la cantidad aportada por el lúpulo de forma directa, complicando poder separar la diferencia encontrada de un error experimental, de un error de medición, de la variación intrínseca a un lote de pellets o a distintas cocciones. 

De hecho en el trabajo de (Cibaka et al., 2017), además de  mostrar la existencia de glucósidos en varias variedades de lúpulo, llegan a conclusiones similares. Por un lado, encuentran una muy baja eficiencia (<14%) de la liberación de aglicona, incluso utilizando una enzima exógena y, por el otro, encuentran que la cantidad de glucósidos de terpenos es pequeña en relación con la cantidad del terpeno presente en el lúpulo de forma «libre» (es decir no conjugada en un glucósido y por ende con impacto aromático). El siguiente gráfico, extraído de dicho trabajo, muestra dicha situación visualmente para las variedades de lúpulos que analizaron (todas ellas variedades muy utilizadas para adiciones aromáticas y de dry hop). Cabe resaltar que limitaron el análisis sólo a ciertos terpenos (todos ellos considerados de alto impacto aromático en cervezas lupuladas). 

cibaka
Concentraciones (mg / kg de lúpulo) de monoterpenos libres (línea discontinua) y de las correspondientes agliconas (línea continua) liberadas a través del tratamiento con β-glucosidasa.

Volviendo al análisis de los estudios positivos, también cabe mencionar que tampoco analizaron qué impacto real podría tener la diferencia producida, gracias a la hidrólisis enzimática de glucósidos,  sobre la percepción aromática. De hecho, en la conclusión del trabajo (Kollmannsberger, Biendl, & Nitz, 2006), muy citado al momento de hablar de biotransformación (mediante hidrólisis enzimática de glucósidos) los autores dicen «aunque sus cantidades totales son muy bajas, parece posible que el linalool [..] liberado de los glucósidos del lúpulo, pueda contribuir al aroma y sabor a lúpulo de la cerveza». Nótese el uso del potencial («parece posible») y la referencia a las bajas cantidades; ambas indicando que los autores veían que hacía falta más experimentación para poder afirmar que la bioconversión (mediante hidrólisis enzimática de glucósidos) tiene un impacto aromático.

Otro eje a considerar es que varios de los estudios «positivos» mencionados trabajaron con extractos. Ergo, sería interesante realizar los mismos ensayos de (Sharp, Steensels, & Shellhammer, 2017) con extractos utilizados en whirlpool o dry hop (no todos los extractos pueden ser usados como dry hop por cuestiones de solubilidad). También sería interesante evaluar si mediante el uso de enzimas exógenas es posible mejorar la performance aromática del producto “American Noble Hops» de Yakima Chief Hops, ya que el mismo es una especie de concentrado de la materia vegetal del lúpulo (sin las glándulas de lupulina), que es una de las partes del lúpulo dónde se han detectado glicósidos (Murakami, Navarro, Ryder, & Goldstein, 2006).

Conclusión

Se ha demostrado que las concentraciones de glucósidos en el mosto y/o cerveza son relativamente bajos, y que la actividad de la β-glucosidasa de la levadura también es baja. Por lo tanto no es probable que la biotransformación debida a la hidrólisis de glucósidos produzca contribuciones significativas al aroma de la cerveza; en relación a su umbral de percepción en la cerveza, la cantidad de los compuestos aromáticos sujetos a ser liberados ya presentes de forma directa, y la variabilidad intrínseca entre lotes de lúpulo y batches de cerveza. Es más, tampoco es probable que la utilización de enzimas β-glucosidasa exógenas aumenten significativamente la extracción aromática (a partir de la hidrólisis de glucósidos).

La única posibilidad alentadora es que ninguno de los estudios contempla la liberación de tioles aromáticos, que si bien se encuentran en muy baja cantidad en el lúpulo y en cervezas lupuladas, estudios recientes han resaltado que tienen un impacto muy importante en el perfil aromático de los lúpulos y las cervezas. Su medición es muy compleja técnicamente, así que sólo queda esperar a ver si alguno de los pocos laboratorios con la tecnología necesaria para detectar las concentraciones halladas en cerveza, repite los ensayos de hidrólisis de glucósidos analizando su efecto sobre tioles conjugados.

Referencias

  • Cibaka, M.-L. K., Ferreira, C. S., Decourrière, L., Lorenzo-Alonso, C.-J., Bodart, E., & Collin, S. (2017). Dry Hopping with the Dual-Purpose Varieties Amarillo, Citra, Hallertau Blanc, Mosaic, and Sorachi Ace: Minor Contribution of Hop Terpenol Glucosides to Beer Flavors. Journal of the American Society of Brewing Chemists75(2), 122–129. https://doi.org/10.1094/asbcj-2017-2257-01
  • Daenen, L., Saison, D., Sterckx, F., Delvaux, F. R., Verachtert, H., & Derdelinckx, G. (2007). Screening and evaluation of the glucoside hydrolase activity in Saccharomyces and Brettanomyces brewing yeasts. Journal of Applied Microbiology. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03566.x
  • Daenen, L., Sterckx, F., Delvaux, F., Verachtert, H., & Derdelinckx, G. (2008). Evaluation of the glycoside hydrolase activity of a Brettanomyces strain on glycosides from sour cherry (Prunus cerasus L.) used in the production of special fruit beers. FEMS Yeast Research8(7), 1103–1114. https://doi.org/10.1111/j.1567-1364.2008.00421.x
  • Goldstein, H., Ting, P., Navarro, A., & Ryder, D. (1999). Water-soluble hop flavor precursors and their role in beer flavor. Proceedings of congress European Brewery Convention, 27, 53–62.
  • Kollmannsberger, H., Biendl, M., & Nitz, S. (2006). Occurrence of glycosidically bound flavour compounds in hops, hop products and beer. Monatsschr. Brauwiss5, 83–89.
  • Murakami, A., Navarro, A., Ryder, D., & Goldstein, H. (2006). Use of glycosides extracted from hop plant parts to flavor malt beverages. Retrieved from https://patents.google.com/patent/US20030211788
  • Praet, T., Van Opstaele, F., Jaskula-Goiris, B., Aerts, G., & De Cooman, L. (2012). Biotransformations of hop-derived aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae upon fermentation. Cerevisia36(4), 125–132. https://doi.org/10.1016/j.cervis.2011.12.005
  • Sharp, D. C., Steensels, J., & Shellhammer, T. H. (2017). The effect of hopping regime, cultivar and β -glucosidase activity on monoterpene alcohol concentrations in wort and beer. Journal of the Institute of Brewing123(2), 185–191. https://doi.org/10.1002/jib.418
  • Takoi, K., Koie, K., Itoga, Y., Katayama, Y., Shimase, M., Nakayama, Y., & Watari, J. (2010). Biotransformation of Hop-Derived Monoterpene Alcohols by Lager Yeast and Their Contribution to the Flavor of Hopped Beer. Journal of Agricultural and Food Chemistry58(8), 5050–5058. https://doi.org/10.1021/jf1000524

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